연구개요 본 연구는 인간 메신저 RNA의 스플라이싱 과정에 관여하며 망막색소변성증, 척수성 근위축증 등과 같은 질환에 관여되어 있다고 알려진 ‘비-핵내저분자 리보핵단백질’ 복합체의 구성단백질 및 초거대분자복합체의 입체구조에 대한 실마리를 마련하기 위하여, 인간 비-핵내저분자 리보핵단백질 중에서 가장 대표적이며 실질적으로 핵내저 분자 리보핵단백질의 기능을 돕는 Prp19 복합체의 구조를 분석하고 이들의 작동에 대한 분자 수준의 근거를 마련할 수 있었다. 따라서, 인간 Prp19 복합체를 이루는 구성단백질 중에서 이러한 복합체의 구조적 뼈대를 마련하는 CTNNBL1과 CDC5L, AD002(CWC15)의 미시적 상호작용에 대한 과학적 이해를 도울 수 있었다. 연구 목표대비 연구결과 비-핵내저분자 리보핵단백질 복합체인 인간 Prp19 복합체를 구성하는 핵심 단백질 CTNNBL1-CDC5L CTNNBL1-AD002 그리고 CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체 복합체 입체구조와 architecture를 규명하는 것이 연구 목표였다. 이를 위하여 AD002의 유전자원을 확보하여 대량생산이 가능함을 확인하였다. CTNNBL1-AD002 복합체의 대량생산을 위하여 다양한 길이를 가지는 AD002 partial construct를 제작하였고 선행연구를 통하여 CTNNBL1이 동질 이합체로 존재할 것이라는 것을 제안하였기 때문에 이러한 동질 이합체와의 결합에 중요한 AD002 도메인 및 잔기를 규정하였다. 이러한 AD002 4개 구조체 중에서 F와 C로 명명된 구조체를 이용하여 이질 이량체의 정제에 성공하였으며 정제된 CTNNBL1-AD002 복합체를 음성 전자현미경 이미지를 얻을 수 있었다. CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체의 구조를 파악하기 위하여 CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체의 정제에 성공하였고 이의 전자현미경 이미지를 얻었다. 그러나 복합체가 깨어진 모양을 보여 이러한 정제 전략을 다시 수립하였다. 안정하게 형성된 CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체의 정제가 가능한지 평가하기 위하여 각 단위체의 다양한 구조체를 제작, 조합하였다. 삼량체의 대량 생산을 위하여 CTNNBL1_77 구조체, CDC5L_6 구조체, AD002_full 구조체를 공동발현시켜 정제하였을 때 약 25mg 이상의 순수한 CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체를 생산할 수 있었다. 그러나 고해상도의 결정구조 획득에 실패하였기 때문에 Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) 기법을 통하여 동적 architecture를 규명하였다. 연구개발결과의 중요성 본 연구를 통하여 인간 CTNNBL1-AD002 이량체, CTNNBL1-CDC5L-AD002 삼량체를 대장균과 같은 이종에서 대량 생산할 수 있는 기술을 확보하였으며, 이렇게 확보된 단백질 복합체를 이용하여 복합체의 구조 정보를 파악할 수 있었다. AD002가 CTNNBL1과 상호작용하는 파트너라는 것은 기존에 알려져 있었지만 어떻게 결합할 수 있는가에 대한 구조적 정보가 빈약하였다. 본 연구를 통하여 새롭게 발견한 것은 CTNNBL1이 AD002의 coiled-coil 부위를 포함하는 C-terminal domain 부분과 상호작용한다는 것이며, SAXS 실험을 통하여 결합에 따른 CTNNBL1의 구조적 변화를 포함하여 이러한 결합 동적 구조에 대한 윤곽을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 용액내에서 2:2의 stoichiometry로 상호작용한다는 것을 알려주었다. 비-핵내저분자 리보핵단백질 복합체의 기능 저하로 인하여 발생하는 여러 질환은 구성 단백질에 다양한 돌연변이가 생겼을 경우 발생하게 된다. 따라서 이러한 구조 정보를 통하여 어떻게 질환이 발병하게 되었는가에 대한 이해를 도울 수 있기 때문에 중요하다고 할 수 있다. (출처 : 요약문 3p)
- 연구책임자 : 김경진
- 주관연구기관 : 경북대학교
- 발행년도 : 20200300
- Keyword : 1. RNA 스플라이싱;스플라이소좀;단백질 구조;비-핵내저분자 리보핵단백질;단백질 상호작용 ; 2. SAXS;
