□ 연구개요 420여종 kinase library와 Seesaw2.0 system를 가지고 스크리닝한 인산화 효소가 DNA 손상 복구 시스템에 미치는 영향을 확인하고, 이미 스크리닝한 Akt1이 DNA 손상 복구 시스템에 미치는 영향을 확인하고 Akt1에 의한 새로운 DNA 손상 복구 시스템의 기전 제시와 세포와 마우스를 이용하여 1-2차년도 생화학적 기초실험들을 바탕으로 새로운 인산화 효소에 의해 DNA 손상 복구 시스템을 조절 관련된 단백질의 동정 및 조절인자의 분자기전 규명을 이해함으로써 DNA 손상 복구 시스템의 새로운 조절인자들을 타겟으로 DNA 손상에 의한 발암기전에 대한 이해를 확립하고자 함. □ 연구 목표대비 연구결과 1. Akt1 억제제에 의한 비상동 말단연결 복구 메커니즘의 영향. - U20S 세포주에서 Fok1 endonulase을 활용하여 DNA 손상에 의한 Akt 억제제의 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였음. Fok1 엔도뉴클레이즈는 DNA의 일부분에 결합하여 절단을 일으킴. 이 방법을 통하여 DNA 손상을 일으킨 후 DNA 손상 부위에 필수적인 인자들의 영향을 관찰하였음. 대표적인 DNA 손상 마커인 gH2AX와 R NF168은 손상 후 Fok1과 같은 위치에서 확인할 수 있었고, 반면에 Akt 억제제인 M K2206을 처리하자 이들이 DNA 손상부위로 모이지 못하는 것을 확인하였음. 2. Akt1에 의한 RNF168 인산화가 RNF168 안정성에 미치는 영향. - Akt1에 의하여 RNF168의 인산화가 RNF168 단백질 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 HEK 293 세포에 GFP-RNF168 본래의 형태와 인산화가 일어날 수 없는 형태인 S60A,인산화가 이미 일어난 구조를 나타내는 S60D , S60E를 발현시켰음. 이들의 단백질의 반감기를 확인한 결과, RNF168 인산화가 일어날 수 없는 형태에서 단백질 반감기가 현저히 감소되는 결과를 확인하였음. 이러한 현상이 HE K 293 세포내에서 Akt1 발현을 막았을때와, DNA에 손상이 일어났을 때의 영향을 확인하기 위해 IR (Ionizing radiation) 이온화 방사선을 투과한 후 RNF168 단백질의 반감기를 확인하였음. 그 결과 Akt1 발현을 막았을때 RNF168 단백질의 안정성이 현저히 감소됨을 확인하였음. 3. Akt1에 의한 RNF168 인산화가 RNF168 안정성에 미치는 영향. - Akt1에 의하여 RNF168의 인산화가 RNF168 단백질 안정성에 영향을 미치는 지 확인하기 위하여 HEK293 세포에 GFP-RNF168 본래의 형태와 인산화가 일어날 수 없는 형태인 S60A, 인산화가 이미 일어난 구조를 나타내는 S60D, S60E를 발현시켰음. 이들의 단백질의 안정성을 확인하기 위하여 knock-down 기법을 이용하여 단백질의 유비퀴틴화를 확인하였음. Akt1이 knock-down 되었을 때, RNF168의 유비퀴틴화를 확인하기 위하여 endogenous 유비퀴틴 항체를 이용하여 실험을 수행하였음. Akt1이 knock-down 되었을 때 GFP-RNF168 본래의 형태와 인산화가 일어날 수 없는 형태인 S60A의 유비퀴틴화를 비교해 보았을 때, GFP-RNF168 본래의 형태의 경우 Akt1 knock-down에 의하여 유비퀴틴화가 증가됨을 확인할 수 있었음. 이를 통해 Akt1에 의하여 RNF168의 유비퀴틴을 통하여 단백질의 안정성을 조절함을 확인하였음. □ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성) 생물학적 시스템에서 DNA 손상반응 조절 기전을 분자수준에서 밝힘으로써 생체의 항상성에 대한 시스템간의 이해를 높이고 목표 집약적인 연구를 통하여 국제적으로 DNA 손상 반응 기전 연구의 발전에 공헌과 DNA 손상 반응에 관여하는 조절인자들과 상호작용하는 조절 분자들 간의 인식네트워크를 구축하여 DNA손상 반응 제어를 위한 물질개발과 효능의 검증이 기대됨. (출처 : 연구결과 요약문 2p)
- 연구책임자 : 박희세
- 주관연구기관 : 전남대학교
- 발행년도 : 20220300
- Keyword : 1. 인산화 효소 Akt1;E3 리가아제 RNF168;DNA 손상 반응;이중가닥절단 복구;상동재조합; 2. Akt1;RNF168;DNA repair system;Double Stand Break Repair;homologous recombination;